Связь регенерации с воспалением

Введение

Внебольничная пневмония (ВП) — одно из самых распространенных острых инфекционных заболеваний в мире, возникающее вне стационара или диагностированное в первые 2 сут от момента госпитализации, характеризующееся вариабельностью клинических проявлений и высоким показателем летальных исходов, особенно среди пожилых людей, детей младшего возраста и пациентов с сопутствующей патологией [1–5]. Летальность от ВП в России составляет 1–30% [1]. Наиболее частым возбудителем ВП является Streptococcus pneumoniae, на втором месте — Staphylococcus aureus [2]. В последние годы ВП нередко становится осложнением гриппозной инфекции, что обусловлено распространением в популяции пандемических штаммов вируса гриппа А (H1N1, H2N2), способного вызывать первичное поражение легочной ткани и развитие быстро прогрессирующей дыхательной недостаточности [3, 6]. ВП при гриппе составляет около 65% всех осложнений [7]. Тяжелое течение ВП связано с развитием синдрома системного воспалительного ответа. Тяжелая форма пневмонии, даже при своевременном и адекватном лечении, часто имеет неблагоприятный исход, осложняясь развитием острого респираторного дистресс-синдрома и сепсиса. В недавнем ретроспективном когортном исследовании было показано, что применение антибиотиков широкого спектра действия в лечении пациентов с пневмонией связано с повышенной смертностью и серьезными осложнениями длительной антибиотикотерапии [8]. Эффективность используемых в настоящее время средств антибактериальной, противовирусной и противовоспалительной терапии весьма ограничена, что связано с целым рядом факторов: ростом антибиотикорезистентности микроорганизмов, выбором неадекватной антибиотико- и противовоспалительной терапии, плохой ответной реакцией пациентов на терапию и, как следствие, отсутствием клинического эффекта [3]. В последние годы во многих ведущих лабораториях мира ведутся экспериментальные исследования по разработке принципиально новых терапевтических подходов, направленных на стимулирование присущей легочной ткани регенеративной способности с целью восстановления структурно-функциональной целостности поврежденного инфекцией альвеолярно-капиллярного барьера, что является необходимым условием полноценного выздоровления при тяжелой пневмонии.

Регенеративный потенциал альвеолярного эпителия

Ключевая роль в защите легких от вдыхаемых инфекционных агентов принадлежит альвеолярному эпителию. При тяжелой пневмонии, вызванной вирусом гриппа, отмечается очаговое разрушение и десквамация бронхиального и альвеолярного эпителия с частичным или полным исчезновением альвеолоцитов (АЦ) [9]. Особенно выраженный тропизм высокопатогенный вирус гриппа проявляет к эпителиальным и эндотелиальным клеткам с высокой пролиферативной способностью [10]. Структурное восстановление поврежденного альвеолярного эпителиального барьера имеет решающее значение для выживания и восстановления легочных функций после тяжелой пневмонии. Неоспоримо доказано, что легочная ткань обладает значительным регенеративным потенциалом, обусловленным наличием популяций тканеспецифичных мультипотентных клеток-предшественников, которые активируются и пролиферируют в ответ на повреждение и способны к долгосрочному самообновлению и дифференцировке в другие клеточные клоны [11, 12]. Популяция стволовых клеток дистальных дыхательных путей, экспрессирующих транскрипционный фактор р63 и кератин 5 (Krt5), обладает мощным пролиферативным потенциалом и способностью дифференцироваться в секреторные клубные, реснитчатые клетки и пневмоциты обоих типов [12, 13]. На модели поражения легких, индуцированного у мышей вирусом гриппа А (H1N1), стволовые клетки дистальных дыхательных путей (p63/Krt5) быстро пролиферировали и мигрировали в поврежденные воспалением альвеолярные локусы, где собирались в дискретные Krt5+-структуры, экспрессирующие типичные для альвеол маркеры [14]. Селективная абляция p63/Krt5-клеток in vivo предотвращала эту регенерацию, приводя к профиброзным поражениям и недостаточному обмену кислорода. Клеточные клоны, полученные in vitro из p63/Krt5-клеток, после трансплантации в инфицированное легкое дифференцировались в пневмоциты I и II типа и в бронхиолярные секреторные клетки, компенсируя потери эндогенных стволовых клеток [14]. Авторы заключают, что p63+Krt5+-популяции клеток принадлежит важная роль в восстановлении альвеолярного компартмента, а возможность размножать эти клетки в культуре свидетельствует об их потенциале в терапии таких заболеваний, как гриппозная пневмония. По мнению W.J. Zacharias et al. [15], основными стволовыми клетками легких, замещающими альвеолярный эпителий во время гриппозной пневмонии, являются пролиферирующие АЦ II типа, экспрессирующие сурфактантный протеин С, имеющие специфическую чувствительность к передаче сигналов Wnt и фактора роста фибробластов (fibroblast growth factor, FGF). При этом Wnt-сигналинг является регулятором, ответственным за трансформацию АЦ II типа в АЦ I типа, а активация рецептора 2 FGF способствует пролиферации самих АЦ II типа. В отличие от других предполагаемых прогениторных клеток, альвеолярные эпителиальные клетки человека, являясь эволюционно консервативным альвеолярным предшественником, могут быть выделены посредством экспрессии консервативного маркера клеточной поверхности TM4SF1, что позволяет рассматривать их как новую цель для разработки регенеративных терапевтических программ при лечении пневмонии [15].

J.W.J. Ong et al. [16] попытались проанализировать относительный вклад двух популяций прогениторных клеток — стволовых клеток дистальных дыхательных путей и АЦ II типа — в раннюю альвеолярную регенерацию во время выздоровления от сублетальной гриппозной пневмонии. Авторы использовали адаптированный для мышей штамм вируса гриппа H1N1, вызывающий серьезное повреждение легких. Стволовые клетки дистальных дыхательных путей начинали мигрировать из бронхиол с 9-го дня после заражения. К 25-му дню, несмотря на восстановление физического здоровья животных, легкие все еще имели признаки повреждения. На этом сроке стволовые клетки дистальных дыхательных путей не экспрессировали маркеры альвеолярных эпителиальных клеток. Первые признаки их дифференцировки в АЦ II типа отмечались к 90-у дню, но даже в течение 200 дней после инфицирования они окончательно не трансформировались в АЦ II типа, а превращались в кисты, выстланные Krt5+-клетками [17]. Напротив, оставшиеся неповрежденными вирусом гриппа АЦ II типа начинали активно делиться в ранние сроки после заражения (15-й день), о чем свидетельствовало увеличение числа клеток, совместно экспрессирующих сурфактантный протеин С и ядерный антиген пролиферирующих клеток [16, 17]. Авторы заключают, что пролиферирующие АЦ II типа являются основными факторами регенерации альвеолярного эпителия на ранней стадии восстановления после сублетальной вирусной пневмонии [16]. На этой стадии пневмонии возможная роль стволовых клеток дистальных дыхательных путей могла состоять в заполнении промежутков, возникающих в результате разрушения пневмоцитов I и II типа, с целью уменьшения инфильтрации воспалительными клетками и проникновения жидкости в альвеолярное пространство [16]. Высказывается предположение, что регенеративный потенциал стволовых клеток дистальных дыхательных путей, связанный с дифференцировкой в АЦ I и II типа, реализуется на более поздних стадиях полного выздоровления от пневмонии [16, 17].

Влияние бактериально-вирусной инфекции на стволовые клетки легких

Молекулярные механизмы влияния бактериальной и вирусной инфекции на прогениторные клетки легких и их регенеративные реакции остаются неясными. Сублетальное заражение мышей S. pneumoniae, наиболее распространенным патогеном ВП, приводило к выраженному повреждению альвеол, но сменялось последующей пролиферацией и дифференцировкой экспрессирующих сурфактантный протеин С АЦ II типа и формированием вновь образованного альвеолярного эпителия [18]. Увеличение активности AЦ II типа было связано с усилением ядерной экспрессии медиаторов сигнального пути Hippo (Yap/Taz). У мышей-мутантов, у которых в АЦ II типа отсутствовали белки Yap/Taz, бактериальная пневмония характеризовалась длительно текущим воспалением в легких и задержкой регенерации альвеолярного эпителия. Несостоятельная регенерация альвеолярного эпителия сопровождалась неспособностью активировать ингибиторную молекулу IκBα, которая прекращает опосредованные NF-κB воспалительные реакции. Деление AЦ II типа подавлялось как микроРНК Yар1, так и ингибитором Hippo, что также подтверждает ключевую роль протеинов сигнального пути Hippo в механизме пролиферации АЦ II типа [19]. Ранее J. Quantius et al. [10], используя культуры легочных эпителиальных стволовых клеток и модели индуцированной вирусом гриппа пневмонии, обнаружили, что инфицированные вирусом эпителиальные прогениторные клетки теряли способность к обновлению и восстановлению альвеолярной ткани вследствие вызванной вирусом блокады Wnt/β-катенин-сигнального пути и рецептора фактора роста фибробластов 2b (FGFR2b), запускающего эпителиально-мезенхимальный регенеративный каскад. Внутритрахеальное введение экзогенного FGF10 для индукции передачи сигналов FGFR2b приводило к увеличению пролиферативного потенциала неинфицированных стволовых клеток, восстановлению функции альвеолярного барьера и увеличению показателя выживаемости после гриппозной пневмонии. Авторы не исключают возможность применения экзогенного FGF10 в качестве перспективной терапии, направленной на потенцирование легочной регенерации при гриппозной пневмонии [10].

A. Khatri et al. [20] в исследовании, проведенном на мышиной модели пневмонии, вызванной S. aureus и S. pneumoniae, раскрыли ранее неизвестную роль Abelson (Abl)-тирозинкиназ в регуляции регенерации легочного эпителия после патогенного повреждения. В экспериментах генетическая и фармакологическая инактивация Abl-тирозинкиназ вызывала мобилизацию секреторных клеток из дистальных дыхательных путей и бронхиоло-альвеолярных соединений, что сопровождалось увеличением популяции клеток с двойной экспрессией, включая маркер АЦ II типа сурфактантный протеин С (Scgb1a1+ + SP C+). Усиленная регенерация поврежденного альвеолярного эпителия происходила в течение 4–24 ч после заражения и способствовала ускоренному выздоровлению мышей от пневмонии. Авторы полагают, что инактивация Abl-киназ с помощью Abl-специфических аллостерических ингибиторов, применяемых в клинике для лечения лейкемии (например, иматиниба), может быть рассмотрена в качестве терапевтической стратегии, способствующей регенерации легких в ответ на повреждение, вызванное различными возбудителями.

Регенерация и воспаление

Ключевым фактором регенерации легочной ткани является запускаемое инфекцией воспаление [21, 22]. Молекулярные процессы, связанные с регенерацией, могут маскироваться происходящими одновременно воспалительными процессами. Возбудители пневмонии и ассоциированные с повреждением молекулярные структуры (danger-associated molecular patterns, DAMP) через Toll-подобные рецепторы индуцируют активацию NF-κB-сигнального пути в резидентных альвеолярных макрофагах, что приводит к усиленной секреции хемокинов CXCL8 и CXCL11 [23]. Под влиянием повышенной концентрации этих воспалительных хемокинов увеличивается приток в легкие нейтрофилов, продуцирующих интерферон-гамма (IFN-γ), и CD4+ Т-хелперов Th1, которые, в свою очередь, усиливают секрецию провоспалительных цитокинов и протеолитических ферментов в альвеолярных макрофагах, формируя «положительную воспалительную петлю» в поврежденных инфекцией легких [24]. Взаимосвязь между воспалительными и регенеративными процессами в легких до настоящего времени неясна. Однако на существование тесной связи воспаления и регенерации указывают результаты, полученные на мышах-мутантах Yap/Taz, когда отсутствие регуляторных сигналов, ослабляющих активность воспалительного процесса, предотвращало формирование адекватной регенеративной ниши, задерживая восстановление поврежденного альвеолярного эпителия при бактериальной пневмонии [18]. По свидетельству J.W.J. Ong et al. [16], на начальном этапе воспаления (7-й день гриппозной пневмонии), когда доминируют врожденные иммунные ответы, формирующие неблагоприятную для регенерации микросреду (высвобождение активных форм кислорода, гипоксия, провоспалительные цитокины), прогениторные клетки не выявлялись. Пролиферация АЦ II типа и локусы стволовых клеток дистальных дыхательных путей регистрировались, когда воспалительный процесс смещался в сторону адаптивных иммунных реакций, что совпадало с 15-м днем развития гриппозной пневмонии [16].

Альвеолярные макрофаги и пневмония

Альвеолярные макрофаги играют чрезвычайно важную роль в бактериальном клиренсе и облегчении бактериальной пневмонии, самой распространенной инфекционной причины смерти во всем мире [25]. Блокирование рекрутирования макрофагов в легкие мышей после сублетального заражения адаптированным вирусом человеческого гриппа A/Aichi/2/68 достигалось обработкой моноклональным антителом против моноцитарного хемотаксического протеина-1 (monocyte chemotactic protein, МСР-1) и приводило к усиленному повреждению альвеолярного эпителия и апоптозу [26]. Культивирование инфицированных вирусом гриппа альвеолярных эпителиоцитов со свежевыделенными альвеолярными макрофагами индуцировало продукцию гепацитарного фактора роста (hepatocyte growth factor, HGF) и фагоцитарную активность макрофагов. Добавление рекомбинантного HGF к эксплантам легкого мыши после заражения вирусом гриппа увеличивало включение BrdU-метки в АЦ II типа, что указывало на их интенсивную пролиферацию и подтверждало активное участие HGF в репарации альвеолярного эпителия при гриппозной пневмонии [26]. Повышенная восприимчивость к внутритрахеальной пневмококковой инфекции у мышей с дефицитом актинсвязывающего протеина L-пластина сочеталась с уменьшением количества альвеолярных макрофагов, что согласуется с критической ролью этого типа клеток в немедленном ответе на пневмококковую инфекцию [27].

Мезенхимальные стволовые клетки в терапии пневмонии

Все большее внимание исследователей привлекают мезенхимальные стволовые клетки (МСК), способные модулировать пролиферацию, активацию и эффекторную функцию всех иммунных клеток воспаления и, кроме того, способные дифференцироваться in vitro в альвеолярные эпителиоциты, что делает их важным перспективным участником клеточной регенеративной терапии тяжелых пневмоний [23, 28, 29]. На рисунке 1 показаны возможные молекулярные механизмы регенеративного эффекта МСК-терапии при пневмонии [23].

МСК по паракринному, зависимому от интерлейкина 10 (IL-10) механизму ослабляли приток нейтрофилов в легкие и уменьшали выработку провоспалительного фактора некроза опухоли α (TNFα), увеличивали способность макрофагов продуцировать противовоспалительный IL-10 PGE2-зависимым образом [23, 30]. Сверхэкспрессия IL-10 в МСК, выделенные из пуповины человека, усиливала иммуномодулирующее действие МСК в условиях модели пневмонии, индуцированной у крыс внутритрахеальным введением Escherichia coli [31]. Альвеолярные макрофаги от зараженных крыс, получавших IL-10-MCК, проявляли повышенную способность к фагоцитированию, что сопровождалось уменьшением числа колоний кишечной палочки и снижением клеточной инфильтрации легочной ткани. Значительно менее выраженными по сравнению с контролем были структурные повреждения легких, на 20% увеличивалась выживаемость животных. Авторы показали, что МСК с избыточной экспрессией IL-10 аналогичным образом усиливали функцию альвеолярных макрофагов человека, иллюстрируя тем самым их терапевтический потенциал в лечении индуцированного инфекцией острого респираторного дистресс-синдрома [31]. Благодаря продукции ростовых факторов кератиноцитов (KGF), эндотелия сосудов (VEGF) и гепатоцитов (HGF) MСК предотвращали апоптоз эндотелиальных клеток, способствовали регенерации клеток AЦ II типа и восстановлению альвеолярно-эпителиального барьера в пораженных пневмонией легких [23, 32, 33]. Недавно было обнаружено, что МСК продуцируют микровезикулы (неядерные фрагменты поверхностных мембран), которые усиливают фагоцитарную активность альвеолярных макрофагов, что приводит к облегчению бактериальной пневмонии, вызванной грамотрицательной кишечной палочкой [34]. Помимо этого, МСК секретируют антибактериальные белки, непосредственно подавляющие рост бактерий в очагах легочного воспаления, способствуя тем самым формированию регенеративных ниш для обновления поврежденного альвеолярного эпителия [34].

МикроРНК в терапии пневмонии

В исследованиях последних лет выявлен регенеративный эффект терапии, основанной на использовании микро­РНК, стимулирующей регенерацию альвеолоцитов и ускоряющей восстановление организма после бактериальной пневмонии. Процесс регенерации альвеолярных эпителиальных клеток, поврежденных в результате заражения мышей S. pneumoniae, сопровождался увеличением в них экспрессии микроРНК-302 [35, 36]. Лечение инфицированных мышей микроРНК-302 улучшало функции легких и повышало выживаемость. Терапевтические эффекты мик­роРНК-302 были опосредованы не путем ингибирования апоптоза и предотвращения повреждения, а путем стимулирования пролиферации локальных эпителиальных клеток-предшественников для регенерации альвеолярного эпителия. В легочной ткани мышей, инфицированных суб­летальной дозой вируса гриппа A (H1N1), через 7 и 15 дней после заражения оценивали экспрессию около 300 мик­роРНК и 36 000 генов с использованием микрочипов [37]. Анализ выявил специфические микроРНК, активно участвующие в нацеливании на репарацию соответствующих функций генов, такие как микроРНК-290 и микроРНК-505 (через 7 дней после заражения) и микроРНК-21 и микро­РНК-30 (через 15 дней после заражения). Дифференциально регулируемые микроРНК участвуют в активации/подавлении клеточной пролиферации и поддержании стволовых клеток, необходимых при восстановлении поврежденных легочных локусов. Эти результаты предоставляют возможности для разработки новых стратегий восстановления при легочном повреждении, вызванном гриппозной инфекцией.

Заключение

Таким образом, результаты экспериментальных исследований последних 5 лет свидетельствуют о перспективности включения в стратегию лечения ВП подходов, направленных на стимулирование заложенного природой огромного регенеративного потенциала легких, прежде всего альвеолярного эпителия, наиболее подверженного инфекционному поражению. Решающее значение для выживания после перенесенной тяжелой пневмонии и восстановления легочных функций имеет регенеративная способность альвеолярного эпителия. Предлагаются различные пути активации основных прогениторных клеток эпителия — АЦ II типа — и перепрограммирования сигнальных систем, участвующих в запуске эпителиально-мезенхимального регенеративного каскада. Необходимы дальнейшие исследования взаимосвязи протекающих одновременно воспалительных и регенеративных процессов и установление факторов, позволяющих регулировать интенсивность этих процессов с целью формирования благоприятной для регенерации микросреды.